GV3101(pSoup-p19)：100μl/支  
pGs2（controlvector，10ng/μl)10μl  
保存條件(保質(zhì)期)：-80℃（12個(gè)月）  
基因型  
C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline(pSoup-p19-tetR)  
產(chǎn)品說(shuō)明  
p19蛋白來(lái)源于番茄叢矮病毒，可抑制宿主對外源基因的RNA沉默效應，提高異源基因轉錄本的穩定性，進(jìn)而促進(jìn)異源蛋白的表達，廣泛應用于轉基因植物及煙草葉片，擬南芥葉片，番茄葉片或原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達系統中。GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉入help質(zhì)粒：pSoup-p19即為GV3101(pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2等質(zhì)粒在農桿菌中復制，同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉基因操作。本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup-p19)化學(xué)轉化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉化效率>103cfu/μgDNA。  
操作方法  
1.取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。  
2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA（轉化效率較高，第一次使用前最好做預實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。  
3.加入700μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2~3小時(shí)。  
4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天（當平板只含有50μg/mlkan時(shí)，28℃培養48h即可；平板中同時(shí)加入50μg/mlkan，20μg/mlrif時(shí)，需28℃培養60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif則需要28℃培養72-90h）。  
注意事項  
1.加入質(zhì)粒時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。  
2.轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量，本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup-p19)化學(xué)轉化感受態(tài)細胞具有四環(huán)素抗性，但在轉入目標質(zhì)粒涂板篩選陽(yáng)性克隆時(shí)，只需加入目標質(zhì)?？剐缘目股?，不加四環(huán)素。  
3.平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養不足，陽(yáng)性克隆生長(cháng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。  
4.利福平濃度不應高于25μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農桿菌生長(cháng)，會(huì )降低其生長(cháng)速度和轉化效率。  
5.培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(cháng)、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農桿菌的轉基因操作，培養農桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
備注

1、農桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

 
2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調PH到7.0	調PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調PH到7.0	調PH到7.0
			Agar	－	15 g