EHA101電擊感受態(tài)細胞 ,根癌農桿菌電擊感受態(tài)
| 別名: | |||
|---|---|---|---|
| Cas號: | 物化性質(zhì): | ||
| 分子式: | 熔點(diǎn): | ||
| 分子量: | 沸點(diǎn): | ||
| EINECS編號: | 密度: | ||
| MDL號: | 儲存條件: | ||
EHA101 Elec： 50μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期)： -80℃（12個(gè)月）
基因型
C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline
產(chǎn)品說(shuō)明
EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作。本公司的EHA101電轉感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉化：經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (壯觀(guān)霉素抗性，size:11876 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pK7WGF2-ZH質(zhì)粒（size:40 kb）檢測轉化效率可達5×103 cfu/μg DNA。。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，第一次使用前最好做預實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動(dòng)電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天
（當平板只含有轉化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90小時(shí)）。
備注
1、農桿菌相關(guān)抗生素配方：
2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
3、LB及YEB配方：
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作。轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養不足，陽(yáng)性克隆生長(cháng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農桿菌生長(cháng)，會(huì )降低其生長(cháng)速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(cháng)、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
pK7WGF2（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期)： -80℃（12個(gè)月）
基因型
C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline
產(chǎn)品說(shuō)明
EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作。本公司的EHA101電轉感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉化：經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (壯觀(guān)霉素抗性，size:11876 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pK7WGF2-ZH質(zhì)粒（size:40 kb）檢測轉化效率可達5×103 cfu/μg DNA。。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，第一次使用前最好做預實(shí)驗確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動(dòng)電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無(wú)抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天
（當平板只含有轉化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90小時(shí)）。
備注
1、農桿菌相關(guān)抗生素配方：
| 抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
| 羧芐青霉素（carb） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
| 硫酸卡那霉素（kan） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
| 鏈霉素（strep） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
| 利福平（rif） | DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
| 慶大霉素（gent） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
| 農桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
| AGL-1 | R | S | R | S | S |
| EHA101 | S | S | R | S | R |
| EHA105 | S | S | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | S | R | R | S
|
3、LB及YEB配方：
| component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
| Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
| Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
| NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
| NaOH | 調PH到7.0 | 調PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
| Agar | － | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
| NaOH | 調PH到7.0 | 調PH到7.0 | |||
| Agar | － | 15 g |
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉化效率下降一個(gè)數量級。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作。轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養不足，陽(yáng)性克隆生長(cháng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農桿菌生長(cháng)，會(huì )降低其生長(cháng)速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(cháng)、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
搜索質(zhì)檢報告(COA)
搜索MSDS
EHA101電擊感受態(tài)細胞
